Wie man Basalmembran Stiffness als biophysikalische Auslöser in Prostatakrebs und andere altersbedingte Pathologien oder Stoffwechselkrankheiten Studie

Zusammenfassung

Hier erklären wir ein Protokoll für die Modellierung der biophysikalischen Mikroumgebung, wo die Vernetzung und eine erhöhte Steifigkeit der Basalmembran (BM), induziert durch Advanced Glycation Endprodukten (AGEs) pathologische Relevanz hat.

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll , das verwendet werden kann , die biophysikalischen Mikroumgebung zu studieren im Zusammenhang mit erhöhter Dicke und Steifigkeit der Basalmembran (BM) während der altersbedingten Erkrankungen und Stoffwechselstörungen (wie Krebs, Diabetes, der mikrovaskulären Krankheit, Retinopathie, Nephropathie und Neuropathie) . Die Prämisse des Modells ist nicht enzymatische Vernetzung von rekonstituierten BM (RBM) -Matrix durch Behandlung mit Glykolaldehyd (GLA) Advanced Glycation-Endprodukt (AGE) Erzeugung über die Maillard-Reaktion zu fördern. Beispiele von Labortechniken, die verwendet werden können, um AGE Erzeugung nichtenzymatische Vernetzungs- und erhöhte Steifigkeit in GLA behandelten rBM skizziert bestätigen. Dazu gehören Herstellung von nativem rBM (behandelt mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, PBS) und steif rBM (behandelt mit GLA) zur Bestimmung von: sein AGE-Gehalt mittels photometrischer Analyse und Immunfluoreszenz-Mikroskopie, seine nicht-enzymatische Vernetzung durch Natriumdodecylsulfat-PolyacrylamidGelelektrophorese (SDS-PAGE) sowie konfokale Mikroskopie und ihre erhöhte Steifigkeit mit rheometry. Das hier beschriebene Verfahren kann die Steifigkeit (Elastizitätsmodul, E) von rBM bis zu 3,2-fache, im Einklang mit Messungen in gesunden gegenüber erkrankten menschlichen Prostatagewebe zu erhöhen, verwendet werden. Um die biophysikalischen Mikro neu mit der Alterung und erkrankten Prostata Drüse drei Prostata-Zelltypen wurden auf nativen rBM eingeführt und steif rBM: RWPE-1, Prostata-Epithelzellen (PEC), die von einer normalen Prostata; BPH-1, Pecs von einer Prostata durch gutartige Prostata-Hyperplasie (BPH) betroffen abgeleitet; und PC3, metastatischen Zellen aus einem sekundären Knochentumor abgeleitet von Prostatakrebs stammt. Mehrere Parameter können gemessen werden, einschließlich der Größe, Form und invasive Eigenschaften des 3D-Drüsenacini von RWPE-1 gebildet und BPH-1 auf nativen im Vergleich zu steifen rBM und mittlere Zelllänge, Migrationsgeschwindigkeit und die Persistenz der Zellbewegung von 3D spheroids von PC3-Zellen unter den gleichen Bedingungen gebildet. Zell-Signalwege und die subzelluläre Lokalisierung von Proteinen kann auch beurteilt werden.

Einleitung

Die Basalmembran (BM) ist eine Schicht aus spezialisierter extrazellulärer Matrix (EZM), die stabile Gewebegrenzen aufrechterhält, indem sie Schichten von Epithelzellen vom Stroma^{trennt 1}. Die kovalente Vernetzung zwischen benachbarten Dreifachhelices von Kollagen IV im BM stabilisiert ihre laterale Assoziation, indem sie ein unregelmäßiges Netzwerk von superverdrillten Helices^{etabliert 2}. Diese Kollagen-IV-Gitter dienen als Gerüst für seine Wechselwirkung mit Laminin und anderen BM-Komponenten¹. Die strukturelle Anordnung des BM verleiht ihm die mechanische Festigkeit und Steifigkeit, die für die normale Entwicklung der Drüsenepithelien erforderlich sind³.

Während des Alterns und der Krankheit verdickt und versteift sich der BM^{allmählich 3,4}. So kommt es in der Normalbevölkerung zwischen dem 50. und 80. Lebensjahr zu einer 3-fachen Erhöhung des Elastizitätsmoduls (E) des Augen-BM und bei Stoffwechselstörungen wie Diabetes⁵ zu einer weiteren Versteifung. Die strukturellen und biomechanischen Veränderungen im BM, die zu seiner erhöhten Steifigkeit führen, treten auf, wenn seine EZM-Komponenten, Kollagen IV und Laminin, nach Exposition gegenüber fortgeschrittenen Glykationsendprodukten (AGEs) nicht-enzymatisch vernetzt werden.

Der Zweck der hier beschriebenen Methode war es, ein Modell für die Untersuchung zu etablieren, wie die BM-Steifigkeit aufgrund der AGE-Exposition die Invasivität von Prostataepithelzellen (PEC) und Prostatatumorzellen (PTC) im Zusammenhang mit dem Wechsel zu metastasiertem Prostatakrebs (PCa) fördert. Zu diesem Zweck wurde ein bisheriges Verfahren zur Erzeugung von 3D-Drüsenacini aus Brustepithelzellen (MECs) in rekonstituierten rBM-Gelen⁶ um einen zusätzlichen Schritt erweitert, bei dem die rBM-Gele mit Glykolaldehyd (GLA) vorbehandelt werden. Es werden verschiedene Techniken zur Beurteilung der GLA-induzierten Vernetzung und Versteifung von vorbehandelten rBM-Gelen beschrieben, darunter photometrische Analyse, Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS PAGE), konfokale Mikroskopie und rheometrische Analyse. Zu den Prostatazelltypen, die für die Kultivierung auf dem vorversteiften rBM ausgewählt wurden, gehören: RWPE-1, PECs, die von einer normalen Prostata abgeleitet wurden⁷; BPH-1, PECs, die von einer von BPH⁸ betroffenen Prostata stammen; und PC3, metastasierende PTCs, die von einem Sekundärtumor stammen, der sich im Wirbelknochen eines Patienten mit Prostatakrebs (PCa) befindet⁹.

Neben der Weiterentwicklung der Erforschung der Prostatapathologie kann das Protokoll zur Versteifung von rBM-Gelen durch ihre Behandlung mit GLA angepasst werden, um zu untersuchen, wie die BM-Steifigkeit zu anderen altersbedingten Pathologien und Stoffwechselstörungen beiträgt. So kann das Modell beispielsweise direkt angewendet werden, um zu untersuchen, wie metastasierender Krebs durch BM-Steifigkeit in Organen wie Brust, Dickdarm, Eierstock und Bauchspeicheldrüse durch den Einbau geeigneter Zelltypen induziert wird. Darüber hinaus kann das Protokoll angepasst werden, um zu untersuchen, wie die steife BM die biomechanischen Mechanismen des Fortschreitens der Erkrankung bei diabetesbedingten mikrovaskulären Erkrankungen, Retinopathie, Nephropathie und Neuropathie fördert.

Protokoll

1. Induktion von BM Stiffness induziert durch GLA Behandlung (Nichtenzymatische Crosslinking)

1. Tauen Sie eine gefrorene Fläschchen mit BM-Matrix (10 ml) durch bei 4 ° C inkubiert (stehend auf Eis in einem kalten Raum oder Kühlschrank), bis der Inhalt des Fläschchens geworden Flüssigkeit (8-16 h).
   Achtung: Wenn ein kalter Raum / Kühlschrank nicht verwendet wird, decken die gesamte Flasche mit Eis. Dies wird die Stammlösung von BM verfestigt verhindern.
2. Für zukünftige Experimente und wiederholten Gefrier-Auftau-Zyklen vermeiden, sind die 25 x 0,4 ml Aliquots aus jeder neuen 10 ml Fläschchen mit BM-Matrix. Shop Fläschchen bei -80 ° C bis zum Ablauf der vom Hersteller angegebene Datum. Bei Bedarf, Vials auftauen bei 4 ° C, die auf Eis für 2 Stunden.
3. Bereiten Sie eine ebene Oberfläche des Eises. Platzieren eines 8-Well-Kammerobjektträger auf der Oberseite der Eis eine Temperatur von 4 ° C während des Beschichtungsverfahrens aufrechterhalten. Auftauen ein Fläschchen mit BM-Matrix bei 4 ° C.
   Hinweis: Ein 0,4-ml-Ampulle von BM Matrix coa ausreichend ist,t eine ganze 1 x 8-Well-Kammer-Folie. Halten Sie das Fläschchen mit Eis bedeckt, während die Handhabung der BM Matrix verfestigt zu verhindern.
4. Schneiden Sie das Abgabeende einer 200 ul Pipettenspitze mit einer Schere ab. Kühlen Sie die glatten Enden 200 ul Pipettenspitze auf 4 ° C und legen Sie es auf eine 200 & mgr; l Kapazität Pipettierhilfe. Nehmen Sie bis 40 ul der kalten BM Matrix-Lösung in die Pipettenspitze und gibt sie in eine auf dem besten gekühlt 8-Well-Kammerobjektträger aus Glas.
   Hinweis: 40 ul BM - Lösung genügt , um eine Fläche von 0,8 cm ² zu bedecken. Halten von Pipettenspitzen während des Beschichtungsverfahrens gekühlt Erstarren der BM-Lösung zu vermeiden. Keine Luftblasen in die BM Matrixlösung einzuführen und sorgen für die gut gleichmäßig ohne die Bildung eines sichtbaren Meniskus an den Kanten beschichtet wird.
5. Wiederholen Sie Schritt 1.4 nach der Anzahl von Vertiefungen und Kammern erforderlich.
6. Nach der Beschichtung, legen Sie die 8-Well-Kammerobjektträger bei 37 ° C für 30 min Polymerisation zu förderndes BM. Schließen Sie den Inkubator Tür sehr sorgfältig unerwünschte Störung der Flüssigkeit rBM zu vermeiden. Überschreiten Sie nicht die 30 Minuten Inkubationszeit Dehydrierung des rBM Gel zu vermeiden.
   Hinweis: Das erhaltene Gel ist das native Rekonstitution BM (RBM). Die 37 ° C Inkubationsschritt erfordert keine 5% CO _2. Doch für die Bequemlichkeit , diesen Schritt in einer bei 37 ° C und 5% CO ₂ (mit Befeuchtung) eingestellt Gewebekultur - Inkubator durchführen.
7. Vorbereitung 50 mM Glykolaldehyd (GLA), verdünnt in 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,8). Sterilisieren der Lösung, indem sie durch einen 0,22 Mikron-Spritzenfilter unter Verwendung einer 50 ml Spritze übergeben.
   1. Für eine Vernetzungsreaktion in einem Endvolumen von 250 ul 50 mM GLA, werden 25 & mgr; l von 0,5 M Natriumcyanoborhydrid oder 2,5 M Aminoguanidin bis 125 & mgr; l 100 mM GLA (2x stock) und 100 ul 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,8 ). Sterilisieren der Stammlösungen, indem sie durch einen 0,22-Mikron-Spritzenfilter mit einer 50-ml-Spritze vorbei.
      Vorsicht: Behandeln Sie Natriumcyanoborhydrid einen Laborkittel, Handschuhe, Gesichtsmaske und Atemschutzmaske tragen, während in einem Abzug arbeiten.
8. In 250 ul GLA Lösung des polymerisierten rBM Gel zu bedecken und für 6 Stunden bei 37 ° C inkubieren einen halbsteifen rBM Gel oder 14 Stunden, um eine steife rBM Gel herzustellen.
   Hinweis: Die Lautstärke von GLA decken hinzugefügt muss das polymerisierte rBM Gel und sollte entsprechend angepasst werden. Wenn verschiedene GLA Inkubationszeiten verwendet werden, sollten die rBM Gele die Falte-Erhöhung der rBM Steifigkeit zu bestimmen, werden analysiert (siehe Schritt 2.4).
   1. Bereiten einer negativen Kontrolle durch ein natives rBM Gel in 250 & mgr; l steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) für 14 Stunden bei 37 ° C inkubiert.
   2. Bereiten zwei weitere Kontrollen, wo die Bildung der Schiff'schen Base oder Amadori-Umlagerung Addukts während der Vernetzungsreaktion gehemmt werden, durch die Zugabe von 50 mM Natriumcyanborhydrid oder 250 mM Aminoguanidin.
9. Bereiten Sie 1 M Glycin ethyl ester (GEE) in PBS verdünnt. Sterilisieren der Lösung, indem sie durch einen 0,22 Mikron-Spritzenfilter unter Verwendung einer 50 ml Spritze übergeben.
10. Nach der angegebenen Inkubationszeit, entfernen Sie vorsichtig die GLA-Lösung aus den vernetzten rBM Gele, GLA Lösung Inhibitoren von den Steuer rBM Gele und PBS aus den Steuer nativen rBM Gele enthalten. In 250 ul GEE Lösung für alle RBM Gele und Inkubation bei 37 ° C für 1 Stunde.
    Anmerkung: Dieser Schritt löscht die Vernetzungsreaktion.
11. Waschen Sie alle rBM Gele 10-mal in 500 & mgr; l PBS alle Spuren von GLA und GEE zu entfernen. Inkubieren der rBM Gele über Nacht bei 37 ° C in 400 & mgr; l PBS, ihre Dehydratisierung zu verhindern.
    1. Analysieren Sie die rBM Gele für AGE Akkumulation, nicht-enzymatische Vernetzung und viskoelastischen Eigenschaften (Schritte 2,1-2,4). Für rheometric Analyse ihrer viskoelastischen Eigenschaften bereiten die rBM Gele in Klonierungsringe (Schritt 2.4).
    2. Für die Zellkultur gründlich rBM Gele 2 mal mit 500 & mgr; l Kultur michdia bevor die Zellen Säen (Schritte 5 und 6). Führen Sie wäscht sanft ohne die Pipettenspitze berühren die Geloberfläche.

2. Quantifizierung der nichtenzymatischen Crosslinking und Stiffness von RBM mit GLA behandelten

1. Photometrische Analyse
   1. Messung der AGE-Akkumulation in GLA-behandelten und Kontroll rBM Gelen mittels photometrischer Analyse des Ausmaßes der Maillard-Reaktion zu bestimmen.
      1. Nach dem Schritt 1.11, die PBS aus rBM Gele in den 8-Brunnen Kammer Dias entfernen und 250 ul eiskaltem doppelt destilliertes Wasser. Inkubieren bei 4 ° C für 16-24 Stunden, um sicherzustellen, daß die Matrix vollständig verflüssigt wird.
         Hinweis: rBM Peptide in dieser Lösung enthalten AGEs mit Auto-Fluoreszenz-Eigenschaften.
      2. Übertragen des verflüssigten BM-Lösung in ein 1,5-ml-Röhrchen und Messen der Fluoreszenzemission der Lösung unter Verwendung eines Spektrophotometers (Anregungswellenlänge = 370 nm; Emissionswellenlänge = 440 nm).
2. SDS-PAGE-Analyse von Cyanogenbromid Peptides
   1. Lösung der GLA-behandelten und Kontroll rBM Gelen auf einem Polyacrylamidgel, um zu bestätigen, dass GLA Vernetzung und die Bildung von Makrofasern induziert wurde.
      1. Zentrifugieren Sie das verflüssigte BM-Lösung in Schritt 2.1.1.2 bei 10.000 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur gesammelt.
      2. Bereiten Sie eine Stammlösung, die 2 g / ml Bromcyan in Acetonitril verdünnt.
         Achtung: Immer Bromcyan in einem Abzug handhaben, während ein Laborkittel, Handschuhe, Gesichtsmaske und Atemschutz tragen.
      3. Entfernen Sie den Überstand resuspendieren das BM-Gel-Pellet in 500 ul 20 mg / ml Bromcyan + 70% v / v Ameisensäure und Inkubation über Nacht bei RT.
      4. Verwenden Sie eine 1 ml Einwegspritze, die erneut suspendiert BM Gel-Pellet in eine Dialysekassette mit einem Molekulargewicht zu übertragen 3,5 kDa abgeschnitten.
      5. Tauchen Sie die Kassette in einen 500-ml-Becherglas, das 500 ml doppelt destilliertem Wasser und einem magnetischen Rührstab.Platzieren dieses auf einem Magnetrührer und dialysiert über Nacht (16 h) bei 4 ° C (in einem kalten Raum), um alle Spuren von Bromcyan und Ameisensäure zu entfernen.
      6. Verwenden Sie eine 1 ml Einwegspritze, die dialysiert BM-Lösung aus der Kassette in ein 1,5-ml-Röhrchen zu übertragen.
      7. Analyse 25 ul jeder Probe BM auf einem 12% v / v Polyacrylamidgel ^10,11. Nach SDS-PAGE, durchführen Silberfärbung des Polyacrylamidgels ¹² die elektrophoretische Muster von Bromcyan-Matrix - Peptide ¹³ sichtbar zu machen.
3. Immunfluoreszenz-Mikroskopie-Analyse
   1. Führen Sie Immunfluoreszenzanfärbung von GLA behandelt und Kontrolle rBM Gele mit anti-AGE / Pentosidin, Anti-Kollagen IV und anti-Laminin durch konfokale Mikroskopie , gefolgt von Antikörpern gegen akkumulierte AGEs und Kollagen IV / Laminin Faserstrukturänderungen in der vernetzten rBM geliert ¹³ visualisieren.
      Hinweis: Immer ein ausreichendes Volumen verwenden, um die enti abzudeckenre rBM Gel während Inkubationen und Waschungen, ohne die rBM Oberfläche mit der Pipettenspitze berühren. Einzelheiten von 3D acini Kulturen durch Immun Analyse siehe Referenz ⁶ und für die konfokale Mikroskopie von 3D acini siehe Referenz ^14.
      1. Wasch GLA behandelten und Kontroll rBM Gelen in 8-wells chamber slides 2 mal mit 300 & mgr; l PBS + (PBS , enthaltend 0,1 mM CaCl ₂ und 0,5 mM MgCl ₂₎ für 5 min bei RT.
      2. Entfernen Sie die PBS + dann 300 ul von 4% w / v Paraformaldehyd (PFA), verdünnt in PBS + jedes rBM Gel zu bedecken. Inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf der RBM-Komponenten zu beheben.
      3. Entfernen Sie die 4% w / v PFA-Lösung. Add 300 ul 75 mM NH ₄ Cl + 0,5 mM MgCl & _sub2 ; -Lösung und Inkubation für 5 min bei RT (repeat 5x) die Fixierung zu quenchen.
      4. Bereiten Sie Immunofluoreszenz - Puffer (IF - Puffer) durch die folgende Lösung in sterilem Wasser Herstellung: 130 mM NaCl, 7 mM Na ₂ HPO _4, 3,5 mM NaH₂ PO _4, 7,7 mM NaN _3, 0,1% w / v Rinderserumalbumin, 0,5% v / v Polyethylenglykol tert- octylphenyl ether und 0,05% v / v Polyethylenglykol Sorbitanmonolaurat.
      5. Bereiten Sie IF-Puffer blockiert durch Ergänzung IF-Puffer mit 20% v / v Ziegenserum.
      6. Entfernen Sie die Lösch Lösung und 300 & mgr; l von IF Blocking-Puffer in den rBM Gele unspezifische Reaktionen zu verhindern. Inkubiere 2 h bei RT auf einem Schütteltisch.
      7. Entfernen Sie die IF-Blockpuffer und Inkubation die rBM Gele für 16 Stunden bei 4 ° C mit 300 & mgr; l primärer Antikörper verdünnt in IF-Puffer blockiert (1: 500 Maus-Anti-Pentosidin mAb; 1/250 Kaninchen-Anti-Kollagen IV pAb; 1 / 250 Kaninchen-anti-Laminin-A / C pAb).
         Anmerkung: Die Inkubationen für länger als 20 Stunden bei 4 ° C kann das rBM verflüssigen.
      8. Entfernen des primären Antikörpers und wasche 3mal (jeweils 10 Minuten) mit 300 ul IF-Puffer bei Raumtemperatur auf einer Schüttelplattform.
      9. Entfernen Sie den IF-Puffer undhinzufügen von 300 & mgr; l des sekundären Antikörpers (Ziege-anti-Kaninchen- oder anti-Maus-IgG [H + L]) mit einem Fluorochrom konjugiert, verdünnt 1: 500 in Blocking-Puffer IF. Inkubieren für 2 Stunden bei RT auf einem Schütteltisch.
      10. Entfernen der sekundäre Antikörper und Inkubation in 300 ul IF-Puffer für 10 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die ZF-Puffer und wasche 3 x 10 min in 300 & mgr; l PBS + bei Raumtemperatur.
      11. Fix und ein zweites Mal zu löschen, wie oben beschrieben (Schritte 2.3.1.2 und 2.3.1.3).
      12. Montieren Sie gefärbten rBM Gele in Eindeckmedien und zu analysieren, um die Bildung von dichten Bündeln von Hauptkomponenten unter Verwendung von Epifluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie.
          Hinweis: Weitere Informationen zur Analyse von 3D - acini Kulturen durch Immunofluoreszenz siehe Referenz ⁶ und für epifluoreszenten und konfokale Mikroskopie von 3D acini siehe Referenz ^14.
4. rheologische Analyse
   1. Führen Sie rheometric Analyse von GLA behandelt und steuern rBM Gele ihre v zu messeniscoelasticity (Steifigkeit).
      1. Richten Sie rBM Gele, die 1 mm dick in eine runde Form mit einem Durchmesser von 8 mm sind. Um dies zu tun, legen Sie einen Klonens Ring (8 mm Durchmesser) in einer Vertiefung einer 24-Well-Kulturplatte und fügen Sie BM Matrix-Lösung hergestellt, wie 1,3-1,6 in den Schritten beschrieben.
         Hinweis: Für eine genaue Wiederholung der rBM Gele für die Experimente verwendet, die rBM Gele für rheometric Analyse vorbereitet müssen die gleiche Fläche und Dicke wie die rBM Gele in den 8-Well-Kammern eingerichtet zu haben. Die rBM Gele in Abbildung 3 analysiert waren 1 mm dick und 8 mm im Durchmesser.
      2. Behandeln Sie die rBM Gele in den Klonierungsringe mit PBS, GLA für 6 Stunden und GLA für 14 Stunden eingestellt, wie oben (Schritte 1,8-1,11) beschrieben.
      3. Messung des Elastizitätsmoduls (E) der 8 mm Durchmesser rBM Gele auf einem Rheometer mit einer 8 mm-Parallelplattengeometrie gezähnt, über einen Bereich von 1-3% Dehnung, bei einer festen Frequenz Schwingung von 1 Hz und einer Temperatur von 21 ° C. Weitere Einzelheiten über dierheometric Analyse von ECM Gele siehe Referenzen Referenz ^13,15,16 sehen.
         Hinweis: E wird aus dem resultierenden Scherspeichermodul (G ') durch die Verwendung der folgenden Gleichung E = 2 * G * bestimmt (1 + v) , wobei v das Verhältnis von 0,5 , der Poisson ist, wie ^13,15 in Referenz ^{, 16.}

3. Kultur und den Umgang mit der Linie Normale PEC, RWPE-1

1. Wachsen RWPE-1-Zellen in Keratinozyten serumfreien Medien (KSFM) supplementiert mit 5 ng / ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), 50 ug / ml Rinder-Hypophysenextrakt (BPE) und 50 U / ml Penicillin mit 50 ug / ml Streptomycin ( Ergänzen KSFM).
   Hinweis: Um die Induktion von epithelialen zu mesenchymalen vermeiden (EMT) -ähnlichen Übergang nicht RWPE-1-Zellen zu Serum aus. Lassen Sie komplette KSFM RT kommen für 30 Minuten nach der von der Lagerung bei 4 ° C zu entfernen und nicht warm in einem 37 ° C Wasserbad, da dies die EGF und BPE inaktivieren.
2. Saugen Sie das kompletteKSFM von einer konfluenten 10 cm ² - Platte von RWPE-1 - Zellen, Spülen mit 5 ml vorgewärmtes PBS und 5 ml 0,05% v / v Trypsin sicherzustellen , dass alle Zellen , die mit der Lösung bedeckt sind.
   1. Platzieren der Zellen in einem Gewebekultur - Inkubator eingestellt bei Standardbedingungen von 37 ° C und 5% CO ₂ (mit Befeuchtung) für 5 bis 10 min. Überprüfen Sie das Ausmaß der Trypsinisierung nach 5 min und vorsichtig auf die Kulturplatte tippen, um die Zellen zu lösen.
      Anmerkung: RWPE-1-Zellen tolerieren keine lange Zeiträume Trypsinisierung so ist es ratsam, nicht mehr als zwei Platten zur gleichen Zeit zu handhaben. Es ist auch wichtig, dass alle Zellen von der Platte zu dissoziieren klonalen Selektion zu vermeiden.
3. Wenn alle RWPE-1-Zellen dissoziiert wurden, mit 5 ml warmem PBS mit 2% v / v fötales Kälberserum (FCS), um das Trypsin zu quenchen. Pipette vorsichtig nach oben und unten die Zellaggregate zu brechen, bevor die Zellen in ein Zentrifugenröhrchen übertragen.
4. Zentrifugieren Sie die distanzierte Zellen bei 125-150 xg für 5 min bei 25 ° C, der Überstand verworfen und erneut zu suspendieren, das Pellet der Zellen in 5 ml komplettem KSFM bis eine Suspension von Einzelzellen erhalten.
5. 1 ml der resuspendierten Zellen in ein neues Röhrchen und fügen 9 ml komplettem KSFM die Zellen bei einer 1 zu propagieren: für nachfolgende experimentelle Verwendung 5 Passage Verdünnung. Zählen Sie die restlichen Zellen mit einer Zählkammer zum Einrichten acini (siehe Abschnitt 5.1).
   Hinweis: Nicht Kultur RWPE-1 - Zellen für mehr als 10 Passagen seit nach längerer Perioden der Kultur , die sie bilden keine acini mit der richtigen Architektur.
6. Ändern Sie den Kulturmedien alle 48 Stunden die EGF und BPE aktiv bleiben, um sicherzustellen.
   Hinweis: Dieses Medium-Änderung für alle Behandlungen, die über 48 Stunden verlängern.

4. Kultur und den Umgang mit der BPH-Zelllinie, BPH-1

1. Kultur BPH-1-Zellen in RPMI 1640-Medium mit 5% v / v FCS ergänzt, 50 U / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin. Warm dasKulturmedien, PBS und 0,25% w / v Trypsin-0,53 M EDTA-Lösung auf 37 ° C vor dem Gebrauch.
   Anmerkung: Die Zellen können auch mit 2,5% v / v FCS ⁸ in Medien kultiviert werden.
2. Saugen Sie das Kulturmedien von einer konfluenten 10 cm ² - Platte von BPH-1 - Zellen und die Zellen werden 2 x mit 3 ml PBS mit Serum alle Spuren von Kulturmedien zu entfernen, um das Trypsin Reaktion auslöschen kann.
3. Saugen Sie das PBS und 3 ml Trypsin-EDTA-Lösung, die Zellen zu decken. Die Platte wird in einem Inkubator eingestellt bei 37 ° C und 5% CO ₂ (mit Befeuchtung) für 5 min. Entfernen Sie die Trypsin-EDTA-Lösung, wenn die Zellen rund, sondern bleiben an der Schale befestigt ist. Wasche die Zellen mit 5 ml PBS.
4. Nach dem Entfernen des PBS, 5 ml Kulturmedien hinzufügen und Pipette nach oben sanft und unten eine Suspension von einzelnen Zellen zu erzeugen. Übertragen Sie die Zellen in ein 15-ml-Tube.
5. Nehmen Sie 2 ml der Zellsuspension in ein neues Zentrifugenröhrchen mit 8 ml komplettem Medium und die Platte die BPH-1-Zellen ONTo 10 cm ² Kulturplatte bei einer 1: 5 Verdünnung Durchgang für die nachfolgende experimentelle Verwendung. Zählen Sie die restlichen Zellen mit einer Zählkammer zum Einrichten acini (siehe Abschnitt 5.2).
   Hinweis: Halten Sie eine Aufzeichnung der Passage-Nummer, wie ältere BPH-1-Zellen nicht acini mit einer richtigen Architektur bilden. Eine Durchgangszahl mehr als 10 ist nicht erwünscht.
6. Ändern Sie den Kulturmedien alle 72 Stunden.

5. 3D-Kultur von Prostata Acini auf Einheimische und Stiff rBM

1. Wenn RWPE-1-Zellen verwendet werden Acini zu bilden, verdünnte 5,000 in Schritt 3.5 in 300 ul vollständiges KSFM hergestellt Zellen ergänzt mit 2% v / v von BM-Lösung.
2. Wenn BPH-1-Zellen verwendet werden Acini zu bilden, verdünnte 2,500 Zellen hergestellt in Schritt 4.5 in 300 ul RPMI 1640-Kulturmedium mit 2% v / v von BM-Lösung ergänzt.
   Anmerkung: BPH-1-Zellen sind größer als RWPE-1-Zellen so geringer Anzahlen von BPH-1-Zellen verwendet werden, eine ähnliche Verteilung der Acini nach 6 Tagen cul zu erhaltentur.
3. Die Zellen vorsichtig auf die nativen und AGE-versteifte Samen rBM und sorgfältig die Kulturen in einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO ₂ (mit Befeuchtung) gesetzt legen eine gleichmäßige Verteilung der wachsenden acini in den Brunnen und dass jede Zelle sich teilt , um sicherzustellen , ein acina zu erzeugen.
4. Alle 2 Tage ersetzt das Kulturmedium mit frischem Kulturmedium, enthaltend 2% v / v BM-Lösung, um sicherzustellen, dass Zellen die Wachstumsfaktoren für normale acina erforderlich Homöostase.
5. Überwachen Sie acinar Morphologie in wachsenden Kulturen mit Hellfeldmikroskopie ^13.
   Anmerkung: Nach 3 Tagen in Kultur einzelner Zellen einen Cluster von> 3 Zellen bilden und nach 1 Woche Prostata Acini mit einem Durchmesser von ~ 50 & mgr; m wird beobachtet werden.
6. Protokoll folgen in 2.3 beschriebenen Immunofluoreszenz auszuführen Antikörper , die für Marker der Zell-Matrix - Adhäsion, Zell-Zell - Adhäsionen, apikal-basal Polarität und Invasivität ¹³ verwendet wird .
   1. Eine Montage Medien mit 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), oder einen zusätzlichen Schritt (nach 2.3.12) Verwenden Sie Zellkerne von 5 min mit DAPI Inkubation und Waschen 2 x 5 min mit PBS + zu färben.

6. 3D-Kultur von Prostata-Tumor-Zellaggregate auf Einheimische und Stiff rBM

1. Kultur PC3-Zellen in RPMI 1640-Medium, enthaltend 10% v / v FCS und 50 U / ml Penicillin mit 50 ug / ml Streptomycin. Erwärmen Sie den Kulturmedien, PBS und 0,25% w / v Trypsin-0,53 M EDTA-Lösung auf 37 ° C vor dem Gebrauch.
2. Saugen Sie das Kulturmedien von einer konfluenten 10 cm ² Kulturschale von PC3 - Zellen und waschen Sie die Zellen mit 3 ml PBS 2x alle Spuren von FCS zu entfernen, um das Trypsin Reaktion löschen kann.
3. Saugen Sie das PBS und 3 ml Trypsin-EDTA-Lösung, die Zellen zu bedecken und für 1 min inkubiert.
4. Wenn sich die Zellen abgerundet, sondern bleiben an der Schale befestigt ist, vorsichtig die Trypsin-EDTA-Lösung ansaugen und wäscht mit 3 ml PBSEntfernen Sie alle Spuren von Trypsin.
5. Nach dem Entfernen des PBS, 5 ml Kulturmedien hinzufügen und Pipette nach oben sanft und unten eine Suspension von einzelnen Zellen zu erzeugen. Übertragen Sie die Zellen in ein 15-ml-Tube.
6. Nimm 1 ml der Zellsuspension PC3 in ein neues Zentrifugenröhrchen eingewogen und 9 ml Kulturmedium. Platte , die Zellen auf einer 10 cm ² Kulturschale (1:10 Verdünnung) für nachfolgende experimentelle Verwendung. Zählen Sie die restlichen Zellen mit einer Zählkammer.
7. Verdünnte 2,500 PC3-Zellen hergestellt in Schritt 6.6 in 300 ul RPMI 1640-Kulturmedium mit 2% v / v von BM-Lösung ergänzt für die Bildung eines Gradienten-Gel in der Kultur zu erlauben.
8. Samen die Zellen vorsichtig auf die nativen und AGE-versteifte rBM und legen Sie sorgfältig die Kultur in den Inkubator bei 37 ° C und 5% CO ₂ (mit Befeuchtung) eingestellt gleichmäßige Verteilung des wachsenden Sphäroiden in den Brunnen zu gewährleisten.
9. Ändern Sie den Kulturmedien alle 72 Stunden.
10. Zur Untersuchung der Wirkung von steifen (AGE-reichen) rBMauf Prostata - Tumorzellmigration, Bild PC3 Zellen Hell- Video Zeitraffer-Mikroskopie Temperatur / CO ₂ -Regelung und eine befeuchtete Kammer ¹⁷ verwendet wird .
    Hinweis: PC3-Zellen in Stränge auf nativen rBM wachsen und nicht mit einem Lumen Acini bilden, aber wenn links mehr als 72 Stunden auf nativen rBM wachsen wird sie 3D-Sphäroiden bilden.
11. Im Anschluss an die Datenerfassung, PC3 Zellen manuell verfolgen und ihre Wanderungsgeschwindigkeit zu berechnen, Form (Dehnungsverhältnis) und die Persistenz der Migration ^17-19.
    Hinweis: Persistenz = Verhältnis D / T, D = Abstand vom Anfang bis zum Ende der Zelle Bahn, T = Gesamtlänge der Zelle Bahn.

Ergebnisse

3D Prostata Acini Cultured auf Stiff rBM

Nach 6 Tagen in Kultur von normalen Prostatagewebe abgeleitet PEC (RWPE-1) (Abbildung 1A) und BPH Gewebe (BPH-1) (Abbildung 1B) Form acini auf nativen (PBS) behandelt rBM , die in einheitliche Sphäroiden von epithelialen organisiert Zellen. Diese acini haben auch die Eigenschaften von hochorganisierten PEC mit apikal-to-basale Polarität und ein sichtbares luminalen Raum ^13,20.

Die durch PECs gebildet Acini abgeleitet von normalem Prostatagewebe (RWPE-1) , (1A) und BPH Gewebe (BPH-1) , (1B) auf versteift (AGE-rich) rBM (behandelt mit GLA) eine gestört Architektur (Verschiebung von rundliche Form und Zellen polygonal vorstehende / von der Acini in die AGE-reiche rBM) (Abbildung 1A Migration). Diese Azini werden auch durch stark desorganisiert PECs gekennzeichnet , daß die apikale-to-basal Polarität mit einem geringen oder nicht vorhandenen luminalen Raum ¹³ verloren haben.

Abb . 1: Prostata - Epithelzellen gewachsen als 3D Drüsenacini auf Einheimische und Stiff rekonstituierte Basalmembran (RBM) (A) Hell Bilder von RWPE-1 - Zellen für 12 Stunden bis zu 6 Tagen auf rBM Gele mit PBS (nativ) behandelt gewachsen oder 50 mM Glykolaldehyd 14 Stunden (AGE-reich; steif); Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. (B) BPH-1 - Zellen, gezüchtet , wie in Feld A beschrieben; Maßstabsbalken = 50 & mgr; m; Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Tabelle 1:. Eigenschaften von epithelialen Prostata RWPE-1 acini gewachsen auf Ureinwohner, Halbsteife und Stiff rekonstituierte Basalmembran (RBM) RWPE-1 Acini wurden auf rBM gewachsen vorbehandelt mit PBS für 14 h (nativ), Glykolaldehyd (GLA ) für 6 Stunden (halbsteifen) oder GLA für 14 Stunden (steif). Für acinar Form ist der Anteil (%) ± Standardabweichung (SD) von rund, halb polygonal und polygonal Acini wurden von 5 unabhängigen Experimenten berechnet (50 acini pro Bedingung quantifiziert). Relative acinar Größe berechnet (native rBM = 100%) von 3 unabhängigen Experimenten. Für Invasivität% ± SD Acini mit einem oder mehreren vorstehenden Zellen wurden aus drei unabhängigen Experimenten berechnet. Falten Änderung wird durch Division des Mittelwerts erhalten unter halbsteifen oder steifen Bedingungen durch den entsprechenden Wert für nativen Bedingungen berechnet. P-Werte berechnet unter Verwendung des Student-t-Test (α = 0,05).

ontent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> AGE erhöht abhängige rBM Steifigkeit fördert Migration PC3 Prostata Tumorzelle

PC3 - Zellen auf nativen rBM gewachsen wandern durch kontinuierliche Zell-Zell - Kontakte zu pflegen hält, während PC3 Zellen auf AGE-reichen (steif) gewachsen rBM bewegen sich unabhängig voneinander (2A). Nach 72 Stunden in Zellen Kultur PC3 Brennpunkte (Sphäroiden) auf nativer Form (PBS) behandelt rBM, während PC3 Zellen auf steif (AGE-reichen) rBM von Sphäroiden nicht und wandern unabhängig (2B). PC3 - Zellen auf steif (AGE-reichen) rBM sind länglicher als PC3 - Zellen gezüchtet auf nativen rBM (Abbildung 2C). PC3 - Zellen auf steifen rBM wandern schneller als PC3 - Zellen gezüchtet auf nativen rBM (2D). PC3 - Zellen auf steifen rBM zeigen eine Abnahme der Persistenz im Vergleich zu PC3 - Zellen gezüchtet auf nativen rBM (Abbildung 2E).

Abbildung 2:. Prostata - Tumor - Zellmigration auf Einheimische und Stiff rekonstituierte Basalmembran (RBM) (A) Hellfeld- Bilder von PC3 - Zellen auf rBM Gele mit PBS (nativ) oder 50 mM Glykolaldehyd 14 Stunden (AGE-reichen, steif) behandelt gewachsen . Die Zellen wurden für 12 Stunden durch Zellbahnen zu erzeugen Tracking gefolgt mit einem Hellfeldmikroskop (10X-Objektiv) und eine Erfassungsrate von 1 Bild pro Stunde abgebildet. Gezeigten Bilder entsprechen den Zeitpunkten nach 0, 3, 6, 9 und 12 Stunden. Trajektorien einzelner Zellen werden für die 12 Stunden Zeitpunkt gezeigt. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. (B) PC3 - Zellen, die auf nativen oder steif rBM für 72 Stunden, und abgebildet wie in Tafel (A) beschrieben. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Detail zeigt ausgewählte Bereich bei 2-facher Vergrößerung. (C) Mittelwert ± SD Zellenlänge (um); signifikanter Unterschied zwischen einheimischen rBM und steifen rBM (p = 1,2 × 10 ^-23). ( (E) Mittelwert ± SD Persistenz der Zellbewegung (Verhältnis D / T, wobei D = Abstand vom Anfang bis zum Ende der Zelle Bahn, T = Gesamtlänge der Zelle Bahn); signifikanter Unterschied zwischen einheimischen rBM und steifen rBM (p = 0,0007). Für Platten CE> 10 Zellen analysiert wurden, werden die Daten repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Ein Protokoll für die Erzeugung von 3D - Drüsenacini von MEC in reinen rBM Gele ⁶ wurde in einer früheren Studie durch die Zugabe von 4 mg / ml Typ I auf der RBM Matrix - Kollagen modifiziert. Die Zugabe von Kollagen resultiert in dem Elastizitätsmodul des Gels rBM Erhöhung von 175 ± 37 bis 1589 ± 380 Pascal. Diese 9,1-fache Erhöhung der Steifigkeit moduliert das Wachstum, Überleben, Migration und Differenzierung von MEC ^21. Das Protokoll wurde erneut modifiziert, indem ein Behandlungsschritt mit D einschließlich - (-) - Ribose nichtenzymatische Vernetzung des Typ-I-Kollagen zu fördern, die dem rBM Gel zugesetzt worden war. Die resultierende 15-fachen Anstieg wurde in der Steifigkeit gefunden mit onkogene Transformation von MEC zusammenzuarbeiten , um deren invasive Verhalten ²² zu fördern. Die experimentelle Vorgehensweise der Zugabe von Typ I-Kollagen-Gelen rBM erleichtert die direkte Wechselwirkung von MEC mit Kollagenfasern, die in menschlichem Gewebe erfolgt erst nach der physischen Barriere zwischen dem Stromaund vom BM bereitgestellt Epithel erfährt proteolytischen Abbau. Durch die Erzeugung von 3D - Drüsenacini von PEC in reinen rBM Gelen vorbehandelt mit GLA, öffnet sich das aktuelle Protokoll , um die Art und Weise zu untersuchen , wie BM Steifigkeit per se können ihre invasive Verhalten auslösen (Abbildung 3). Die Niveaus der Steifigkeit BM in diesem Protokoll physiologische Relevanz induziert. Inkubation mit 50 mM GLA 6 h und 14 h erhöht jeweils die Elastizitätsmoduln des reinen rBM Gel auf 175 ± 90 und 322 ± 160 gegenüber 122 ± 55 Pascal in rBM Gelen behandelt mit PBS (Tabelle 1). Diese 1,7-3,2-fache Erhöhung der Steifigkeit rBM rekapituliert die 2,5- bis 3,4-fache Erhöhung der Steifigkeit in malignen beobachtet im Vergleich zu normalen Prostata oder BPH Gewebe ^23-26. Wie kürzlich in einer Veröffentlichung ¹³ die morphologischen Veränderungen durch die Ansammlung von AGE und rBM Steifigkeit in PEC Acini quantifiziert von ar für eine statistisch signifikante Verschiebung werden kann induziert umrissenenounded zu polygonale Form, verringert luminale / total acinar Bereich und vorspringende Zellen aus dem acina in die AGE-reiche rBM (Abbildung 3) zu migrieren. Immunoblotting können auch Marker für EMT zu bewerten verwendet werden (zB Verlust von E-Cadherin ¹³⁾ und die Kontraktionsverhalten (zB phosphoryliert Myosin Light Chain-2, pMLC2 ¹³⁾ in Pecs in normalen gewachsen im Vergleich zu steifen rBM (Abbildung 3). Frühen endosomalen Antigen 1 und GM130: Eine weitere Bewertung unter Verwendung von Immunfluoreszenzanfärbung und konfokale Mikroskopie kann die BM (zB Laminin, Kollagen IV und AGE Anhäufung ^13), zelluläre apikal-to-basale Polarität (zB apikale Lokalisation von EEA1 zu visualisieren angewendet werden 130 kDa cis-Golgi Marker ¹³⁾ und zelluläre Muster der Adhäsionsmoleküle (zB E-Cadherin - Lokalisierung zu Zell-Zell - Junctions ¹³⁾ (Abbildung 3).

Abbildung 3:. Überblick über die verschiedenen Protokolle hier vorgestellten Das Diagramm zeigt , wie die Vorbereitung und versteifen die rekonstituierte Basalmembran (RBM) mit Glykolaldehyd (Maillard - Reaktion), wie Zellen auf Saatgut auf dem steifen rBM, wie das steife rBM zu analysieren ( Ausmaß der Maillard-Reaktion) und Verfahren, die die zellulären und molekularen Veränderungen verwendet werden können, durch AGE-reiche rBM induziert zu analysieren. AGE, Advanced Glycation Endprodukten; BM, Basalmembran; DAPI, 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindol; EEA1, frühe Endosomen Antigen 1; GAPDH, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase; GLA, Glykolaldehyd; GEE, glycinethylester; GM130, 130 kDa cis-Golgi-Marker; p-MLC2 (Thr18 / Ser19), Myosin Light Chain-2 an den Stellen phosphoryliert Threonin 18 und Serin 19; rBM, rekonstituierte Basalmembran; SDS-PAGE, Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Für RWPE1 acini Maßstabsbalken = 10 & mgr; m; für PC3 TumorzelleSphäroiden Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Diese Zahl hat sich von der Referenz ¹³ geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Schritte zur Fehlerbehebung wird notwendig sein, wenn D - (-) - Ribose als Vernetzungsmittel für rBM gewählt wird. Während die Protokollentwicklung wurde festgestellt , dass die Behandlung mit 1 M D - (-) - Ribose für 72 Stunden, wie zuvor für RBM / Kollagengelen ²² beschrieben, ergab die Dehydratisierung und Schrumpfung von rBM Gelen. Die Auswertung von geringeren Konzentrationen von D - (-) - Ribose und kürzere Behandlungszeiten können dazu beitragen, diese Einschränkung zu überwinden.

Eine mögliche Einschränkung in zukünftigen Anwendungen des Protokolls könnte begegnet werden, bei denen eine höhere rBM Steifigkeit erwünscht sind. Wenn längere Inkubationszeiten und höheren Konzentrationen von GLA induzieren werden verwendet, um höhere rBM Gelsteifheit wird es notwendig sein, beurteilen , ob diese Behandlungsbedingungen einen Einfluss auf das Überleben der Zellen und die Proliferation, wie dies bisher ¹³ beschrieben. Es sollte auch beachtet werden, dass Inkubation von RWPE-1-Zellen mit Serum eine phänotypische EMT artigen Übergang und Exposition gegenüber Serum oder serumhaltigen Materialien sollten vermieden werden induziert. Wenn beispielsweise die Transfektion von Experimenten short interfering RNA (siRNA) Oligonukleotiden beinhalten, sollte das Verfahren RWPE-1-Zellen in KSFM optimiert werden unter Verwendung gewachsen, ohne die Zellen zu niedrigen Serum Transfektionsmedium Schalt. Dieser Nachteil könnte das Niveau des Gens beeinträchtigen erreicht Silencing bei der Verwendung von transienten siRNA im Modellansätze. Für einige Protein-Targets wäre es ratsam, werden induzierbaren shRNA Vektoren für abstimmbare Gen-Silencing und die gewünschte Verringerung der Protein-Ebene einzusetzen. Adaptionen , die ¹⁷ enzymatische Vernetzung durch Stromazellen oder Tumorzelle assoziiert Lysyloxidase (LOX) übernehmen könnte auch in Zukunft Modelle eingebaut werden.

jove_content "> Dieses Protokoll wird die künftige Untersuchung von Pro-invasive Mechanismen ausgelöst durch altersabhängige BM Steifigkeit in Pecs (RWPE-1, BPH-1) und Bewertung von anti-metastatischen Ziele in invasive PTCs (PC3) erleichtern. Da BPH wird als eine Stoffwechselstörung , ^27, dieses Protokoll zu sein ebnet auch den Weg zu unserem verbesserten Verständnis des Zusammenhangs zwischen Stoffwechselstörungen und einem erhöhten Risiko von Prostatakrebs. Da durch die Einwirkung von AGEs induzierte BM Steifigkeit in anderen Krebs ein Auslöser für Invasivität sein kann Arten, wird es interessant sein , um das Protokoll zu verwenden , ähnliche Modelle zu schaffen , die normalen Epithelzellen und Tumorzellen von anderen Organen (zB Brust-, Dickdarm-, Ovarien, Pankreas) integrieren.

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls zusammen mit ihren Zeitpunkten, sind in 4 zusammengefasst. In der ersten Stufe ist es wichtig , die Stammlösung von rBM bei 4 ° C zu halten , während es auftaut seine pol zu verhindernymerization. Pipettenspitzen sollten nicht in die rM Stammlösung gelegt werden, bis sie auf 4 ° C gekühlt wurden. Für den nächsten Schritt ist es auch wichtig, die chamber slides äquilibriert auf 4 ° C haben, um sicherzustellen, bevor sie mit der rBM Lösung beschichtet sind. Sobald die Temperatur der Lösung rBM über 4 ° C erhöht wird, wird es irreversible polymerisieren unter Bildung eines Gels. Es ist wichtig, dass die rBM nicht während der Polymerisationsstufe gestört, um sicherzustellen, dass es sich um eine selbst bildet für die Zellkultur und mikroskopische Analyse geeignete Oberfläche. Die Dauer der Inkubation mit GLA mit oder ohne Inhibitoren der Maillard-Reaktion (Natriumcyanoborhydrid und amingoguanidine) wird bestimmen, wie steif RBM Gel wird. Es wird empfohlen , einen 6 - stündigen Inkubation mit GLA ​​zu verwenden , wenn halbsteifen Bedingungen erforderlich sind, und 14 Stunden Inkubation , wenn steife Bedingungen erforderlich sind (Tabelle 1). Alternative Inkubationszeiten oder Konzentrationen von GLA können, wenn verschiedene Ebenen verwendet werdenSteifigkeit erwünscht. In diesem Fall rheologische Analyse der rBM Gelen benötigen als einen wesentlichen Schritt eingebaut werden. Nach dem Schritt der Maillard-Reaktion durch Inkubation mit GEE und die nachfolgenden Waschschritte mit PBS Abschrecken können die rBM Gele bei 4 ° C gelagert oder sofort verwendet werden, für bis zu 48 Stunden vor ihrer Verwendung für die Zellkultur. Sobald Zellkulturen eingerichtet sind ist es wichtig, die Kulturmedium zu ändern (einschließlich aller Behandlungen) alle zwei Tage. Es wird empfohlen, die 3D-Zellkulturen für 3-12 Tage zu halten nach den Parametern untersucht. Für die 3D-PEC acini empfiehlt es sich, die Kulturen nach 6 Tagen zu analysieren und für die 3D-PTC-Analyse Sphäroide nach 3 Tagen der Kultur in erster Linie empfohlen.

Abbildung 4:. Einfache Übersicht des Protokolls mit kritischen Schritte und Timings zeigte die flow Diagramm zeigt, wie die Vorbereitung und die rekonstituierte Basalmembran (RBM) mit Glykolaldehyd (Maillard-Reaktion) mit kritischen Schritte und Zeiten angegeben versteifen. Punkte, wo das Protokoll kann angehalten werden, und Gele rBM gespeichert sind ebenfalls angegeben. rBM, rekonstituierte Basalmembran; GLA, Glykolaldehyd; GEE, glycinethylester; ON, über Nacht; PBS, Phosphat-gepufferte Salzlösung; RT, Raumtemperatur. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
I - Material für Monolayer-Kultur
BPH-1	CaP Zelllinien-Datenbank	PCaCL-132	Kontakt: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu
Vollständiges keratinozytenserumfreies Medium	ThermoFisher Scientific	17005-075	Nicht bei 37 °C erwärmen; C vor der Anwendung
Fötales Kälberserum	First Link UK Ltd	02-00-850	Store at -20 º C in Aliquoten
PC3	American Type Culture Collection	CRL-1435
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15070-063
Phosphatpuffer Kochsalzlösung (Dulbecco A) Tabletten	Oxoid	BR0014G
RPMI 1640 medium	Sigma-Aldrich	R5886	warm in 37 º C Wasserbad vor Gebrauch
RWPE-1	American Type Culture Collection	CRL-11609
Trypsin-EDTA-Lösung	Sigma-Aldrich	T4049
Name	Company<	strong>Katalognummer	>
II - Material für 3D-Kultur
Acetonitril	Sigma-Aldrich	271004
Aminoguanidinhydrochlorid	Sigma-Aldrich	396494	Reizt Augen, Atemwege und Haut
Kammer-Objektträger, 8-Well	Thermo Scientific Nunc Lab-Tek	TKT-210-816M
Kulturmatrix mit rekonstituierter Basalmembran (rBM) Extrakt aus reduziertem Wachstumsfaktor	AMS Biotechnology	3445-005-01	Lagern Sie die Basalmembran (BM) bei -80 º C in Aliquoten
Cyanogenbromid	Sigma-Aldrich	C91492	Giftig bei Berührung mit der Haut und Inhalation
Ameisensäure	Sigma-Aldrich	695076
Glycinethylesterhydrochlorid (GEE)	Sigma-Aldrich	50060	Reizt die Augen
Glykolaldehyd-Dimer (GLA)	Sigma-Aldrich	G6805
Natriumcyanoborohydrid	Sigma-Aldrich	71435	Leicht entflammbar; Giftig durch Kontakt mit der Haut und Inhalation
Spritzenfilter 0,22 Mikrometer	Appleton Woods	BC680
Name	Company	<>Katalognummer<	strong>Kommentare
III - Material zur Quantifizierung der Maillard-Reaktion
4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)	ThemoFisher Scientific	D3571	lichtempfindlich und lagerbar bei -20 º C in Aliquoten
Klonierungszylinder	Sigma-Aldrich	C1059
Ziege Anti-Maus IgG (H+L) Alexa Fluor 488 Konjugat	ThemoFisher Scientific	A-11001	lichtempfindlich
Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) Alexa Fluor 488 Konjugat	ThemoFisher Scientific	A-11034	lichtempfindliches
Ziegenserum	Abcam	ab7481	Bei -20 º C in aliquoten
Vectashield Eindeckmedien	Vector Laboratories	H-1000
Maus Anti-Pentosidin-Klon PEN-12 mAb	TransGenic Inc	KH012
Paraformaldehyd (PFA)	Sigma-Aldrich	F8775	Lagern bei -20 º C in Aliquoten
Kaninchen Anti-Human-Kollagen IV polyklonaler Antikörper	Acris Antikörper	R1041	Lagern bei -20 º C in aliquots
Kaninchen Anti-Laminin A/C pAb	Santa Cruz Biotechnology Inc	sc-7292	Lagern bei -20 º C in Aliquoten
Polyethylenglykol tert-octylphenylether (Triton-X100)	Sigma-Aldrich	T9284
Polyethylenglykol-Sorbitanmonolaurat (Tween-20)	Sigma-Aldrich	P1379
Dialysekassette Slide-A-Lyzer	ThemoFisher Scientific	66333<
strong>Name	Company	< strong>Katalognummer	Kommentare
IV - Ausrüstung
ARG2 Rotationsrheometer mit kontrollierter Dehnung	T.A. Instruments
Axiovert S100 (20-fache Vergrößerung)	Mikroskop Zeiss
CO2-gesteuerte befeuchtete Inkubationskammer für Zeiss Axio S100 Mikroskop	Solent Scientific
Confocal Axiovert 200M (40-fache, 63-fache Vergrößerung)	Zeiss
Olympus LH50A Mikroskop mit einer Digitalkamera mit Phasenkontrast	Olympus
PHERAstar Plus Plattenleser Spektralphotometer	BMG Labtech
Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
V - Software
Image J 1.47v	Nationales Institut für Gesundheit, USA
MetaXpress	Molekulare